Molecular Cancer | circFNDC3B編碼蛋白可抑制結腸癌!

發布時間:2020-04-13 11:14     文章來源:未知     作者:百替生物

circRNA翻譯是非常受關注的研究思路,近幾年已經有十余篇研究報道。近日,一項發表在Molecular Cancer》(IF=10.679)的來自中山大學附屬第三醫院鄭俊和張磊悉尼大學Storr肝病研究中心喬梁教授一項circRNA翻譯蛋白的研究工作,該研究報道結腸癌中circFNDC3B編碼蛋白可以抑制Snai1表達并抑制EMT和腫瘤進展!
 

 

 

結腸癌中circFNDC3B的發現和鑒定

 

circFNDC3B由FNDC3B基因的5和6外顯子形成,作者設計反向引物驗證了結腸癌中circFNDC3B的存在,Sanger測序驗證了接口位置的序列。RNase R實驗,放線菌素D實驗,FISH實驗分析了circFNDC3B分子的基本情況,結果顯示circFNDC3B主要定位在細胞質中。臨床標本檢測結果表明circFNDC3B在結腸癌中顯著低表達,臨床標本中,circFNDC3B表達低的患者預后更差。

 

圖1 結腸癌中circFNDC3B的發現和鑒定

 

circFNDC3B抑制細胞增殖和遷移侵襲

 

功能實驗表明過表達circFNDC3B抑制細胞增殖和遷移侵襲,干擾circFNDC3B則促進細胞增殖和遷移侵襲。

 

圖2 circFNDC3B抑制細胞增殖和遷移侵襲

 

circFND3B編碼蛋白鑒定

 

序列分析表明circFNDC3B存在一個大于一圈的ORF。circFNDC3B長度526nt,這個一圈多的ORF總長度657nt,預測的蛋白序列有218aa。序列比對的結果顯示這個218aa的序列的N端有一段不同于FNDC3B母基因蛋白的獨有序列。ORF的上游有一段序列可能有IRES的功能,熒光素酶報告基因的驗證證明了這一段的確具有IRES功能。

 

為驗證circFNDC3B的翻譯產物,作者構建了四個載體進行驗證分析:

(1)Lv-vector:慢病毒空載體。

(2)Lv-circFNDC3B-flag:將Flag序列融合至預測ORF中。融合位置為ORF的中間,避免了這種ORF占了一圈多的情況下在N端或C端融合導致的插入Flag序列對ORF的改變過大的問題。本文的Flag融合位置設計在93位氨基酸后面,該位置避開了ORF終止密碼子的位置(circFNDC3B-218aa的終止密碼子與91和92位的氨基酸有序列交疊)。

(3)Lv-circFNDC3B-flag-mut:Flag序列融合至ORF中,但其實密碼子突變為ACG。

(4)Lv-circFNDC3B-218aa:直接表達線性的circFNDC3B-218aa ORF,C端融合Flag序列。

 

四種病毒載體感染細胞后,有circFNDC3B的載體顯著增加了circRNA的表達水平,但所有的載體對FNDC3B母基因的影響都非常低。WB實驗驗證了circFNDC3B-218aa的翻譯產物,用了兩種抗體檢測:一個是anti-Flag的抗體,驗證了融合Flag后的circFNDC3B-218aa表達,起始密碼子突變后這個條帶消失。另一個是anti-FNDC3B的一種商業化抗體,也可以識別circFNDC3B-218aa,這種商業化抗體也檢測到了Flag融合后的蛋白條帶,同時在病毒載體表達產物不能準確翻譯circFNDC3B-218aa的兩組中也有很弱的條帶出現,可能是細胞內源circFNDC3B-218aa產物的條帶。最后,作者從IP產物的蛋白質譜中找到了具有circFNDC3B-218aa特有氨基酸序列的蛋白質譜峰。

 

圖3 circFNDC3B編碼蛋白鑒定

 

circFNDC3B功能機制研究

 

前面的結果中circFNDC3B具有抑制細胞增殖和遷移侵襲的作用,那么是circFNDC3B作為非編碼RNA的屬性起的作用,還是其編碼的蛋白起的作用呢?基于上述設計的突變載體,作者分析了四種載體的功能情況,結果表明circFNDC3B-218aa是發揮功能的關鍵。
 

圖4 circFNDC3B編碼蛋白而非RNA發揮功能

 

體內實驗也證明circFNDC3B-218aa可顯著抑制腫瘤生長速度。起始密碼子突變后的circFNDC3B影響不明顯。
 

圖5 circFNDC3B-218aa體內抑制腫瘤生長

 

為分析circFNDC3B-218aa的功能機制,作者通過RNA-seq分析了過表達circFNDC3B-218aa前后基因表達差異情況。發現circFNDC3B-218aa可以促進FBP1的表達而抑制Snai1的表達。細胞和動物實驗的標本也驗證了這些現象。
 
圖6 circFNDC3B-218aa調控Snail和FBP1表達
 
已知Snai1可以負調控FBP1的表達,那么circFNDC3B-218aa是不是通過Snai1調控了FBP1的表達呢?作者通過過表達circFNDC3B-218aa后過表達Snail的實驗驗證了這個假設。單獨過表達circFNDC3B-218aa能抑制腫瘤遷移侵襲,但同時過表達Snail能抵消單獨過表達circFNDC3B-218aa的效應。
 
圖7  circFNDC3B-218aa通過Snai1調控FBP1 
 
circFNDC3B在結腸癌中通過翻譯一個218aa的蛋白,負調控Snai1的表達,進而釋放了Snai1對FBP1的抑制效應,FBP1進而抑制EMT,抑制腫瘤進展。
圖8 circFNDC3B-218aa功能機制模型
 
本文關于circRNA翻譯蛋白的研究相對比較全面,對于circRNA翻譯產物的驗證和鑒定有較高的參考價值。美中不足的是對天然表達的circFNDC3B-218aa蛋白的WB驗證實驗證據偏少,只有在商業化抗體驗證的實驗中有兩個對照組的條帶結果,如果能在細胞系(如NCM460細胞等非腫瘤細胞系)或病人標本組織(癌旁組織,非腫瘤的結腸組織等等)中驗證一下天然的circFNDC3B-218aa分子就更全面了。

 

參考文獻:

1. Pan, Z., et al., A novel protein encoded by circFNDC3B inhibits tumor progression and EMT through regulating Snail in colon cancer. Mol Cancer. 2020.

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